Course Syllabus
Obiettivi
Obiettivo di questo insegnamento è fornire agli studenti una conoscenza di base delle più comuni tecniche del DNA ricombinante e di biochimica. L’insegnamento mira inoltre a sviluppare un senso critico nella scelta di strategie di clonaggio, produzione di proteine ricombinanti, per la purificazione di proteine e di metodi per il dosaggio di proteine e dell’attività enzimatica.
Conoscenza e capacità di comprensione - al termine dell'insegnamento lo studente dovrà conoscere la teoria alla base delle principali tecniche di laboratorio biochimico e di tecniche di base per la manipolazione del DNA ricombinante.
Capacità di applicare conoscenza e comprensione - al termine dell'insegnamento lo studente dovrà essere in grado di applicare le conoscenze acquisite nella scelta di un approccio sperimentale per il clonaggio di DNA, la produzione, purificazione e caratterizzazione di proteine; tali conoscenze verranno anche applicate nei corsi successivi, in particolare nel corso di Laboratorio Integrato di Biologia (LIB).
Autonomia di giudizio - al termine dell’insegnamento, lo studente sarà in grado di mettere a punto un protocollo di clonaggio di DNA plasmidico, produzione di proteine ricombinanti, purificazione di proteine e di operare una scelta tra i diversi metodi di caratterizzazione.
Abilità comunicative - alla fine dell'insegnamento lo studente avrà acquisito una terminologia scientifica adeguata e saprà esporre con proprietà di linguaggio gli argomenti trattati nel corso.
Capacità di apprendimento - alla fine dell'insegnamento lo studente sarà in grado di comprendere e valutare criticamente l’uso delle metodologie riportate nella letteratura scientifica.
Contenuti sintetici
Metodi del DNA ricombinante per il clonaggio e la produzione di proteine ricombinanti
Tecniche preparative per l'estrazione e l'arricchimento di proteine
Tecniche preparative per la purificazione di proteine
Tecniche elettroforetiche e di dosaggio
Tecniche per l'analisi della struttura secondaria e terziaria delle proteine
Programma esteso
Metodi del DNA ricombinante
Amplificazione del DNA (polymerase chain reaction)
Elettroforesi del DNA; enzimi di restrizione e di ligazione, scelte di vettori e di ospiti di clonaggio;
Metodi per la produzione di proteine ricombinanti
Tecniche preparative per l'estrazione e l'arricchimento di proteine
Tecniche di lisi cellulare; tamponi e stabilità delle proteine; salting out
Precipitazione e frazionamento in ammonio solfato e dialisi
Tecniche centrifugative (differenziale; in gradiente di densità)
Tecniche preparative per la purificazione di proteine
Cromatografie – principi generali; gel filtrazione; cromatografia a scambio ionico; chromatofocusing; cromatografia in fase inversa; cromatografia idrofobica; cromatografia di affinità
Strategie per la purificazione di proteine
Tecniche elettroforetiche e di dosaggio
Elettroforesi – principi generali; SDS-PAGE; elettroforesi nativa; isoelettrofocalizzazione; elettroforesi bidimensionale; western blotting
Spettroscopia UV-VIS
Metodi di dosaggio della concentrazione proteica e dell’attività enzimatica
Tecniche per l'analisi della struttura secondaria e terziaria delle proteine
Dicroismo circolare
Spettrofluorimetria
Spettrometria di massa
Prerequisiti
È necessaria la conoscenza delle basi della fisica, della chimica generale ed organica e della biochimica. I principi chimico-fisici e le nozioni di biochimica essenziali per la comprensione delle diverse metodologie verranno riassunti all’inizio delle lezioni
Modalità didattica
Lezioni frontali con presentazione powerpoint; video; lezioni partecipate (discussione di dati sperimentali)
Materiale didattico
Slides: reperibili sulla pagina Moodle dell’insegnamento
Libri di testo:
- K. Wilson & J. Walker (2000) “Biochimica e Biologia Molecolare” Cortina, 2006
- M. C. Bonaccorsi di Patti, R. Contestabile, M. L. Di Salvo “Metodologie Biochimiche” Casa Editrice Ambrosiana, 2012
Periodo di erogazione dell'insegnamento
Secondo semestre
Modalità di verifica del profitto e valutazione
Esame scritto + orale. Esame scritto (90 min): consiste nel rispondere a 10 quesiti/esercizi su argomenti teorici e su dati sperimentali ottenuti con le tecniche oggetto di questo insegnamento. Esame orale (ca. 15 min): consiste in una-due domande che, nella maggior parte dei casi, traggono spunto dall’esame scritto. Attraverso entrambe le prove saranno valutate le conoscenze acquisite in ambito teorico e nella interpretazione di dati sperimentali. Sono inoltre valutate le capacità espositive, in base alla loro coerenza e all’utilizzo di un linguaggio scientificamente e tecnicamente appropriato. Il voto di entrambe le prove, scritta e orale, è assegnato in trentesimi. Il voto finale si ottiene dalla media dei due voti.
Orario di ricevimento
Su appuntamento, per mail a stefania.brocca@unimib.it
Aims
The aim of this course is to offer basic knowledge of the most common techniques of recombinant DNA and biochemistry. The course also aims to develop a critical sense in the choice of strategies for DNA cloning, production of recombinant proteins, purification of proteins, methods for quantification of proteins and enzymatic activity.
Knowledge and understanding - at the end of the course, students will know the theory underlying main biochemical laboratory techniques and basic techniques for the manipulation of recombinant DNA.
Ability to apply knowledge and understanding - at the end of the course students will be able to apply the knowledge acquired in choosing experimental approaches for DNA cloning, production, purification and characterization of proteins. This knowledge will also be applied in subsequent courses, in particular in practical course of integrated biology (Laboratorio integrato di biologia – LIB).
Autonomy of judgment - at the end of the course, students will be able to develop a protocol for cloning of plasmidic DNA, production of recombinant protein, protein purification and characterization.
Communication skills - at the end of the course, students are expected to acquire and to use adequate scientific terminology.
Learning skills - at the end of the course, students are expected to understand and critically evaluate the use of the methodologies reported in the scientific literature.
Contents
Recombinant DNA methods for cloning and producing recombinant proteins
Preparatory techniques for the extraction and enrichment of proteins
Preparatory techniques for protein purification
Electrophoretic and dosing techniques
Techniques for the analysis of the secondary and tertiary structure of proteins
Detailed program
Techniques of Recombinant DNA
DNA amplification (polymerase chain reaction)
DNA electrophoresis; restriction and ligation enzymes, choices of vectors and cloning hosts;
Methods for the production of recombinant proteins
Preparatory techniques for the extraction and enrichment of proteins
Cell lysis techniques; buffers and protein stability; salting out
Precipitation and fractionation in ammonium sulphate and dialysis
Centrifugative techniques (differential; in density gradient)
Preparatory techniques for protein purification
Chromatographies - general principles; filtration gel; ion exchange chromatography; chromatofocusing; reverse phase chromatography; hydrophobic chromatography; affinity chromatography
Strategies for protein purification
Electrophoretic and quantification techniques
Electrophoresis - general principles; SDS-PAGE; native electrophoresis; isoelectric focusing; two-dimensional electrophoresis; western blotting
UV-VIS spectroscopy
Quantification of protein concentration and enzymatic activity
Techniques for the analysis of the secondary and tertiary structure of proteins
Circular dichroism
Spectrofluorimetry
Mass spectrometry
Prerequisites
A basic knowledge of general and organic chemistry, physics and biochemistry is essential. The essential physico-chemical principles and biochemistry topics will be reviewed
Teaching form
Classroom lectures based on powerpoint presentations; videos; active learning (discussion of experimental data)
Textbook and teaching resource
PPT slides, published on the Moodle website (http://elearning.unimib.it/).
Textbooks:
- K. Wilson & J. Walker (2010). Principles and Techniques of Biochemistry and Molecular Biology.
- M. C. Bonaccorsi di Patti, R. Contestabile, M. L. Di Salvo “Metodologie Biochimiche” Casa Editrice Ambrosiana, 2012
Semester
Second semester
Assessment method
Written + oral exam. Written exam (90 min) consists in 10 questions / exercises on theoretical topics and on experimental data obtained with the techniques covered by this course. Oral exam (approx. 15 min) consists of one - two questions that, in most cases, are inspired by the written exam. The exam is aimed at evaluating the knowledge acquired in the theoretical field and in the interpretation of experimental data. The linguistic capacities are also assessed, as for the use of scientifically and technically appropriate language. The final grade is obtained by the average of the two marks.
Office hours
On demand, by mail to stefania.brocca@unimib.it
Key information
Staff
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Stefania Brocca