Course Syllabus
Obiettivi
L’insegnamento si propone di fornire conoscenze e competenze relative ai sistemi di espressione in procarioti ed eucarioti; oltre alla caratterizzazione molecolare dei diversi sistemi di espressione verranno considerati aspetti applicativi in campo biotecnologico. Verranno, parallelamente, approfondite metodiche di biologia molecolare utilizzate per l’analisi dell’espressione genica e per lo studio in vivo delle interazioni fra macromolecole.
Conoscenza e capacità di comprensione.
Lo studente conoscerà alcuni sistemi di espressione in procarioti ed eucarioti e le loro applicazioni nell’ambito delle biotecnologie. Parallelamente, acquisirà competenze in metodologie biomolecolari necessarie per lo studio e l’analisi sperimentale dell’espressione genica e delle interazioni fra macromolecole.
Capacità di applicare conoscenza e comprensione.
Lo studente sarà in grado di applicare le conoscenze acquisite nei successivi insegnamenti nel campo delle discipline biomolecolari e in attività di laboratorio. Sarà, inoltre, in grado di comprendere lavori scientifici e avrà le competenze biomolecolari adeguate per sostenere argomentazioni in ambito biotecnologico.
Autonomia di giudizio.
Lo studente sarà in grado di elaborare quanto appreso e di affrontare e discutere criticamente lavori scientifici nell’ambito delle tematiche biomolecolari trattate.
Abilità comunicative.
Lo studente sarà in grado di esprimersi con proprietà di linguaggio nella trattazione di argomenti inerenti le tematiche biomolecolari trattate.
Capacità di apprendimento.
Lo studente sarà in grado di affrontare autonomamente studi successivi che richiedano le conoscenze biomolecolari acquisite applicando il metodo di studio acquisito.
Contenuti sintetici
Analisi qualitativa e quantitativa della trascrizione. Metodi di studio in vivo delle interazioni fra macromolecole. Sistemi di espressione in procarioti ed eucarioti.
Programma esteso
Analisi qualitativa e quantitativa della trascrizione. Northern relativa, Dot blot (ASO probe/diagnosi talassemie), RT-PCR relativa, RT-PCR applicazioni, RACE. Cenni sull’uso dei microarray per lo studio dell’espressione genica. Librerie a cDNA mediante RT-PCR.Tagged random primers-PCR.
Metodi di studio delle interazioni fra macromolecole. One-hybrid (DNA-proteina). Two-hybrid originale, reverse e split hybrid (proteina-proteina). Two-hybrid alternativi (Sos recruitment, Split-ubiquitin). Three hybrid (proteine-proteine, RNA-proteine).
Sistemi di espressione in procarioti. Espressione di proteine in Escherichia coli. Promotori inducibili. Sistemi di fusione per la purificazione di proteine (Ubiquitina, IMPACT).
Sistemi di espressione in eucarioti. Espressione in lievito. Marcatori auxotrofici e dominanti. Vettori (integrativi, episomici, YAC). Biologia del 2 micron. Gene targeting. Inattivazione genica. Pop-in e Pop-out. Vettori di espressione per lievito: promotori costitutivi ed inducibili. Sistema GAL. Plasmid shuffling. Vettori ad autoselezione. Espressione di proteine sia intracellulari che secrete (pathway secretivo e modificazioni co/post-traduzionali delle proteine). Parete cellulare. Yeast-based screening. Yeast surface display: applicazioni.
Espressione in cellule di mammifero. Sistemi di trasfezione di linee cellulari di mammifero. Espressione transiente e trasformanti stabili; marcatori di selezione (tk, dhfr e marcatori dominanti). Promotori costitutivi ed inducibili (Tet-on e Tet-off).
Espressione in cellule di insetto: il sistema del baculovirus.
Prerequisiti
Prerequisiti: Biologia molecolare
Propedeuticità specifiche: Biologia Molecolare I
Propedeuticità generali: Lo studente può sostenere gli esami del terzo anno dopo aver superato tutti gli esami del primo anno di corso
Modalità didattica
Lezioni frontali con l’ausilio di diapositive.
L'insegnamento è tenuto in lingua italiana.
Materiale didattico
Tutto
il materiale didattico è reperibile sulla piattaforma e-learning
dell'insegnamento.
Libri di testo consigliati:
- T.A. Brown “Biotecnologie molecolari” Zanichelli
- M. Maccarrone “Metodologie biochimiche e biomolecolari” Zanichelli
- R.J. Reece “Analisi dei geni e genomi” EdiSES
- J.W. Dale and M. von Schantz “Dai geni ai genomi” EdiSES
Periodo di erogazione dell'insegnamento
Primo semestre
Modalità di verifica del profitto e valutazione
Esame scritto (2 h).
L'esame consiste in domande aperte su argomenti trattati nell’insegnamento. Verrà valutata principalmente la capacità dello studente di “collegamento” dei diversi argomenti trattati.
Orario di ricevimento
Ricevimento: su appuntamento, previa e-mail al docente
Aims
The course aims at elucidating and increasing knowledge of some expression systems in Prokaryotes and Eukaryotes; in addition to the molecular characterization of the different expression systems, applications in the biotechnological field will be considered. Particular attention will also be addressed to different molecular biology techniques that are required for the analysis of gene expression and for the in vivo study of macromolecule interactions.
Knowledge and understanding.
Students will get acquainted with some expression systems in Prokaryotes and Eukaryotes, as well as, their biotechnological applications. In parallel, they will gain knowledge of biomolecular methods required for the study and the experimental approach of gene expression and macromolecule interactions.
Applying knowledge and understanding.
Students will be able to apply the acquired knowledge in subsequent courses in the field of the molecular biology and in laboratory activities. In addition, they will be able to understand scientific papers and will have the biomolecular knowledge required to discuss biotechnology-related subjects.
Making judgments.
Students will be able to elaborate on what they have learned, as well as, to face and critically discuss scientific works in the field of the biomolecular topics covered.
Communication skills.
Students will be able to express themselves appropriately in oral reports concerning the biomolecular topics faced.
Learning skills
Students will have the skills to face autonomously the subsequent studies that require the biomolecular knowledge acquired by applying the acquired study method.
Contents
Qualitative and quantitative transcription analyses. In vivo analyses of macromolecule interactions. Prokaryotic and eukaryotic expression systems.
Detailed program
Qualitative and quantitative transcription analyses. Relative Northern analysis, Dot blot (ASO probe/diagnostic tool for thalassemia), relative RT-PCR, RT-PCR applications, RACE. The microarray technology: an outline. cDNA libraries by RT-PCR. Tagged random primers-PCR.
Analyses of macromolecule interactions. One-hybrid system. Two-hybrid system and its modifications (reverse and split, Split-ubiquitin, Sos recruitment). Three hybrid system.
Prokaryotic expression systems. Protein expression in Escherichia coli. Inducible promoters. Fusion proteins and protein purification (Ubiquitin, IMPACT).
Eukaryotic expression systems. Protein expression in yeast. Selection markers. Episomal and integrative vectors. YACs. The biology of the 2 micron plasmid. Gene targeting. Gene inactivation. Pop-in and Pop-out. Inducible and constitutive promoters. The GAL system. Plasmid shuffling. Autoselection systems. Expression and secretion of proteins (the secretory pathway and the co/post- translational modifications of proteins). The cell wall. Yeast-based screening. Yeast surface display.
Protein expression in mammalian cells. Mammalian cells: transfections. Transient and stable expressions. Selection markers (tk,dhfr and dominant markers). Constitutive and inducible (Tet-on and Tet-off) promoters.
Protein expression in insect cells: the baculovirus system.
Prerequisites
Background: Molecular biology.
Specific prerequisites: Molecular Biology I.
General prerequisites: Students can take the exams of the third year after having passed all the exams of the first year of the course.
Teaching form
Classroom lessons supported with slides.
Teaching language: italian.
Textbook and teaching resource
All
teaching material is available at the e-learning platform of the course.
Recommended textbooks:
- T.A. Brown “Biotecnologie molecolari” Zanichelli
- M. Maccarrone “Metodologie biochimiche e biomolecolari” Zanichelli
- R.J. Reece “Analisi dei geni e genomi” EdiSES
- J.W. Dale and M. von Schantz “Dai geni ai genomi” EdiSES
Semester
First semester
Assessment method
Written examination (2 h).
The examination presents open questions on topics spanning the course program. Mainly, the skills of “interconnection” among the different topics will be assessed.
Office hours
Contact: on demand, upon request by mail to lecturer.
Key information
Staff
-
Marina Vai