Syllabus del corso
Obiettivi
Obiettivo di questo insegnamento è fornire agli studenti una conoscenza di base delle più comuni tecniche del DNA ricombinante e di biochimica. L’insegnamento mira inoltre a sviluppare un senso critico nella scelta di strategie di clonaggio, produzione di proteine ricombinanti, per la purificazione di proteine e di metodi per il dosaggio di proteine e dell’attività enzimatica.
Conoscenza e capacità di comprensione - al termine dell'insegnamento lo studente dovrà conoscere la teoria alla base delle principali tecniche di laboratorio biochimico e di tecniche di base per la manipolazione del DNA ricombinante.
Capacità di applicare conoscenza e comprensione - al termine dell'insegnamento lo studente dovrà essere in grado di applicare le conoscenze acquisite nella scelta di un approccio sperimentale per il clonaggio di DNA, la produzione, purificazione e caratterizzazione di proteine; tali conoscenze verranno anche applicate nei corsi successivi, in particolare nel corso di Laboratorio Integrato di Biologia (LIB).
Autonomia di giudizio - al termine dell’insegnamento, lo studente sarà in grado di mettere a punto un protocollo di clonaggio di DNA plasmidico, produzione di proteine ricombinanti, purificazione di proteine e di operare una scelta tra i diversi metodi di caratterizzazione.
Abilità comunicative - alla fine dell'insegnamento lo studente avrà acquisito una terminologia scientifica adeguata e saprà esporre con proprietà di linguaggio gli argomenti trattati nel corso.
Capacità di apprendimento - alla fine dell'insegnamento lo studente sarà in grado di comprendere e valutare criticamente l’uso delle metodologie riportate nella letteratura scientifica.
Contenuti sintetici
1. Metodi del DNA ricombinante per il clonaggio e la produzione di proteine ricombinanti
2. Tecniche preparative per l'estrazione e l'arricchimento di proteine
3. Tecniche per il dosaggio delle proteine e dell'attività enzimatica
4. Tecniche preparative per la purificazione di proteine
5. Tecniche elettroforetiche ed immunochimiche
6. Tecniche biofisiche per l'analisi conformazionale delle proteine
Programma esteso
1. Metodi del DNA ricombinante, per il clonaggio e la produzione di proteine ricombinanti. Metodi per la produzione di proteine ricombinanti; Enzimi di restrizione e di ligazione; Scelte di vettori e di ospiti di clonaggio; Amplificazione del DNA (polymerase chain reaction); Metodi di estrazione del DNA plasmidico; Elettroforesi del DNA; Introduzione alle tecniche di sequenziamento.
2. Tecniche preparative per l'estrazione e l'arricchimento di proteine. Tecniche centrifugative e di ultrafiltrazione; Precipitazione e frazionamento in ammonio solfato; Tecniche di lisi cellulare e centrifugazione frazionata.
3. Tecniche per il dosaggio delle proteine e dell'attività enzimatica. Dosaggio della concentrazione proteica; Saggi di attività' enzimatica; Tabella di purificazione.
4. Tecniche preparative per la purificazione di proteine. Introduzione alle tecniche cromatografiche; Introduzione alle tecniche cromatografiche; Cromatografia di esclusione molecolare; Cromatografia a scambio ionico; Cromatografia di interazione idrofobica e reverse phase; Cromatografia di affinità; HPLC ed FPLC; Valutare l'andamento di una purificazione.
5. Tecniche elettroforetiche ed immunochimiche. Elettroforesi in condizioni native e denaturanti (SDS-PAGE); Isoelettrofocalizzazione (IEF) ed elettroforesi bidimensionale (2D-PAGE); Western blotting; Introduzione alle tecniche immunochimiche; Immunoprecipitazione, ELISA
6. Tecniche biofisiche per l'analisi conformazionale delle proteine. Spettrometria di massa; Introduzione alla spettrofotometria e assorbimento in UV-vis; Spettroscopia di dicroismo circolare; Spettrofluorimetria; Tecniche di fluorescence resonance energy transfer (FRET).
Prerequisiti
È necessaria la conoscenza di concetti basilari di fisica, chimica generale ed organica. I principi chimico-fisici e le nozioni di biochimica essenziali per la comprensione delle diverse metodologie verranno esposti brevemente o ricordati all’inizio delle lezioni.
Modalità didattica
Lezioni frontali con presentazione powerpoint; video; discussione di dati sperimentali.
Materiale didattico
Slides: reperibili sulla pagina Moodle dell’insegnamento
Libri di testo:
- K. Wilson & J. Walker (2000) “Biochimica e Biologia Molecolare” Cortina, 2006
- M. C. Bonaccorsi di Patti, R. Contestabile, M. L. Di Salvo “Metodologie Biochimiche” Casa Editrice Ambrosiana, 2012
Periodo di erogazione dell'insegnamento
Primo semestre
Modalità di verifica del profitto e valutazione
Esame scritto + orale. Esame scritto (90 min): consiste in 10 quesiti a risposta multipla, 2 esercizi e 2 domande aperte. Esame orale (ca. 15 min): consiste in una-due domande che, nella maggior parte dei casi, traggono spunto dall’esame scritto. Attraverso entrambe le prove saranno valutate le conoscenze acquisite in ambito teorico e nella interpretazione di dati sperimentali. Sono inoltre valutate le capacità espositive, in base alla loro coerenza e all’utilizzo di un linguaggio scientificamente e tecnicamente appropriato. Il voto di entrambe le prove, scritta e orale, è assegnato in trentesimi. Il voto finale si ottiene dalla media dei due voti.
Orario di ricevimento
Su appuntamento, per mail a stefania.brocca@unimib.it
Aims
The aim of this course is to offer basic knowledge of the most common techniques of recombinant DNA and biochemistry. The course also aims to develop a critical sense in the choice of strategies for DNA cloning, production of recombinant proteins, purification of proteins, methods for quantification of proteins and enzymatic activity.
Knowledge and understanding - at the end of the course, students will know the theory underlying main biochemical laboratory techniques and basic techniques for the manipulation of recombinant DNA.
Ability to apply knowledge and understanding - at the end of the course students will be able to apply the knowledge acquired in choosing experimental approaches for DNA cloning, production, purification and characterization of proteins. This knowledge will also be applied in subsequent courses, in particular in practical course of integrated biology (Laboratorio integrato di biologia – LIB).
Autonomy of judgment - at the end of the course, students will be able to develop a protocol for cloning of plasmidic DNA, production of recombinant protein, protein purification and characterization.
Communication skills - at the end of the course, students are expected to acquire and to use adequate scientific terminology.
Learning skills - at the end of the course, students are expected to understand and critically evaluate the use of the methodologies reported in the scientific literature.
Contents
1. Recombinant DNA methods for cloning and production of recombinant proteins
2. Preparative techniques for protein extraction and enrichment
3. Techniques for assaying protein and enzyme activity
4. Preparative techniques for protein purification
5. Electrophoretic and immunochemistry techniques
6. Biophysical techniques for conformational analysis of proteins
Detailed program
1. Recombinant DNA methods for cloning and production of recombinant proteins. Methods for the production of recombinant proteins; Restriction and ligation enzymes; Choices of cloning vectors and hosts; DNA amplification (polymerase chain reaction); Plasmid DNA extraction methods; DNA electrophoresis; Introduction to sequencing techniques.
2. Preparative techniques for protein extraction and enrichment. Centrifugation and ultrafiltration techniques; Ammonium sulfate precipitation and fractionation; Cell lysis and fractional centrifugation techniques.
3. Techniques for protein and enzyme activity assay. Protein concentration assay; Enzyme activity' assays; Purification table.
4. Preparative techniques for protein purification. Introduction to chromatographic techniques; Introduction to chromatographic techniques; Molecular exclusion chromatography; Ion exchange chromatography; Hydrophobic interaction and reverse phase chromatography; Affinity chromatography; HPLC and FPLC; Evaluating the progress of a purification.
5. Electrophoretic and immunochemical techniques. Electrophoresis in native and denaturing conditions (SDS-PAGE); Isoelectrophoresis (IEF) and two-dimensional electrophoresis (2D-PAGE); Western blotting; Introduction to immunochemical techniques; Immunoprecipitation, ELISA
6. Biophysical techniques for protein conformational analysis. Mass spectrometry; Introduction to UV-vis spectrophotometry and absorption; Circular dichroism spectroscopy; Spectrofluorimetry; Fluorescence resonance energy transfer (FRET) techniques.
Prerequisites
Knowledge of basic concepts of physics and general and organic chemistry is required. Most relevant physicochemical principles and biochemistry concepts will be briefly stated or recalled at the beginning of class.
Teaching form
Classroom lectures based on powerpoint presentations; videos; discussion of experimental data.
Textbook and teaching resource
PPT slides, published on the Moodle website (http://elearning.unimib.it/).
Textbooks:
- K. Wilson & J. Walker (2010). Principles and Techniques of Biochemistry and Molecular Biology.
- M. C. Bonaccorsi di Patti, R. Contestabile, M. L. Di Salvo “Metodologie Biochimiche” Casa Editrice Ambrosiana, 2012
Semester
First semester
Assessment method
Written + oral exam. Written exam (90 min): consists of 10 multiple choice questions, 2 exercises and 2 open-endend questions. Oral exam (approx. 15 min): consists of one-two questions that, in most cases, are inspired by the written exam. Through both tests will be evaluated the knowledge acquired in the theoretical field and in the interpretation of experimental data. The expositive abilities are also evaluated, based on their coherence and the use of a scientifically and technically appropriate language. The grade of both tests, written and oral, is assigned in thirtieths. The final grade is obtained from the average of the two marks.
Office hours
On demand, by mail to stefania.brocca@unimib.it
Scheda del corso
Staff
-
Stefania Brocca