Syllabus del corso
Obiettivi
Obiettivo di questo insegnamento è fornire agli studenti una conoscenza di base delle più comuni tecniche biochimiche e del DNA ricombinante. L’insegnamento mira inoltre a descrivere la complementarietà di strategie di clonaggio, produzione di proteine ricombinanti, purificazione di proteine, e loro caratterizzazione strutturale e funzionale, quest'ultima riferita soprattutto all'attività enzimatica.
Conoscenza e capacità di comprensione - al termine dell'insegnamento lo studente dovrà conoscere la teoria alla base delle principali tecniche di laboratorio biochimico e di tecniche di base per la manipolazione del DNA ricombinante.
Capacità di applicare conoscenza e comprensione - al termine dell'insegnamento lo studente dovrà essere in grado di applicare le conoscenze acquisite nella scelta di un approccio sperimentale per il clonaggio di DNA, la produzione, purificazione e caratterizzazione di proteine; tali conoscenze verranno anche applicate nei corsi successivi, in particolare nel corso di Laboratorio Integrato di Biologia (LIB).
Autonomia di giudizio - al termine dell’insegnamento, lo studente sarà in grado di riconoscere e comprendere i passaggi principali di un protocollo di clonaggio di DNA plasmidico, produzione di proteine ricombinanti, purificazione di proteine.
Abilità comunicative - alla fine dell'insegnamento lo studente avrà acquisito un vocabolario tecnico-scientifico adeguato e saprà esporre con proprietà di linguaggio gli argomenti trattati nel corso.
Capacità di apprendimento - alla fine dell'insegnamento è atteso che lo studente sia in grado di comprendere e riconoscere le metodologie apprese entro contesti diversi (ad esempio, in articoli scientifici).
Contenuti sintetici
-
Tecniche preparative per l'estrazione e l'arricchimento di proteine
-
Tecniche elettroforetiche ed immunochimiche
-
Tecniche per il dosaggio delle proteine e dell'attività enzimatica
-
Tecniche preparative per la purificazione di proteine
-
Tecniche biofisiche per l'analisi conformazionale delle proteine
-
Metodi del DNA ricombinante per il clonaggio e la produzione di proteine ricombinanti
Programma esteso
1. Tecniche preparative per l'estrazione e l'arricchimento di proteine. Tecniche centrifugative e di ultrafiltrazione; Precipitazione e frazionamento in ammonio solfato; Tecniche di lisi cellulare e centrifugazione frazionata.
2. Tecniche elettroforetiche ed immunochimiche. Elettroforesi in condizioni native e denaturanti (SDS-PAGE); Isoelettrofocalizzazione (IEF) ed elettroforesi bidimensionale (2D-PAGE); Western blotting; Introduzione alle tecniche immunochimiche; Immunoprecipitazione, ELISA
3. Tecniche per il dosaggio delle proteine e dell'attività enzimatica. Dosaggio della concentrazione proteica; Saggi di attività' enzimatica; Tabella di purificazione.
4. Tecniche preparative per la purificazione di proteine. Introduzione alle tecniche cromatografiche; Introduzione alle tecniche cromatografiche; Cromatografia di esclusione molecolare; Cromatografia a scambio ionico; Cromatografia di interazione idrofobica e reverse phase; Cromatografia di affinità; HPLC ed FPLC; Valutare l'andamento di una purificazione.
5. Tecniche biofisiche per l'analisi conformazionale delle proteine. Introduzione alla spettrofotometria e assorbimento in UV-vis; Spettroscopia di dicroismo circolare; Spettrofluorimetria; Tecniche di fluorescence resonance energy transfer (FRET).
6. Metodi del DNA ricombinante, per il clonaggio e la produzione di proteine ricombinanti. Metodi per la produzione di proteine ricombinanti; Enzimi di restrizione e di ligazione; Scelte di vettori e di ospiti di clonaggio; Amplificazione del DNA (polymerase chain reaction); Metodi di estrazione del DNA plasmidico; Elettroforesi del DNA; Introduzione alle tecniche di sequenziamento..
Prerequisiti
È necessaria la conoscenza di concetti basilari di fisica, chimica generale ed organica. I principi chimico-fisici e le nozioni di biochimica essenziali per la comprensione delle diverse metodologie verranno esposti brevemente o ricapitolati all’inizio delle lezioni.
Modalità didattica
L'insegnamento prevede 24 lezioni (6 CFU) che si svolgeranno in modalità mista: convenzionale “erogativa”, in presenza degli studenti, e “interattiva”, che prevede la partecipazione attiva e il coinvolgimento degli studenti nella analisi e interpretazione di metodi sperimentali provenienti da protocol book; riviste di metodologia scientifica, articoli scientifici.
Ciascuna lezione sarà supportata da presentazioni PowerPoint, video e analisi di metodi sperimentali. In base alle richieste degli studenti frequentanti, potranno essere introdotti nuovi argomenti di studio.
In relazione al numero ed alle richieste degli studenti frequentanti, potranno essere svolti lavori di gruppo, volti all’analisi di metodi sperimentali ed alla loro complementarietà.
Materiale didattico
Libri di testo:
- K. Wilson & J. Walker (2000) “Biochimica e Biologia Molecolare” Cortina, 2006
- M. C. Bonaccorsi di Patti, R. Contestabile, M. L. Di Salvo “Metodologie Biochimiche” Casa Editrice Ambrosiana, 2012
Materiale didattico reperibile sulla pagina Moodle dell’insegnamento:
- Slide delle lezioni
- Domande ed esercizi d'esame
- Articoli scientifici selezionati dal docente
Periodo di erogazione dell'insegnamento
Secondo semestre
Modalità di verifica del profitto e valutazione
Esame scritto + orale.
Esame scritto (60 min): consiste in quesiti a risposta multipla ed esercizi.
Esame orale (ca. 20 min): consiste in due-tre domande su tutto il programma.
Attraverso entrambe le prove saranno valutate le conoscenze acquisite in ambito teorico, nella interpretazione di dati sperimentali, nella capacità di stabilire relazioni di complementarietà tra tecniche e approcci sperimentali diversi. Sono inoltre valutate le capacità espositive, e l’utilizzo di un linguaggio scientificamente e tecnicamente appropriato.
Il voto di entrambe le prove, scritta e orale, è assegnato in trentesimi. Il voto finale si ottiene dalla media dei due voti.
Non sono previste prove in itinere.
Orario di ricevimento
Su appuntamento, per mail a stefania.brocca@unimib.it
Sustainable Development Goals
Aims
The aim of this course is to provide students with a basic knowledge of the most common techniques of biochemistry and molecular biology, aimed at the production of recombinant proteins. The course also aims at describing the complementarity of cloning strategies, production of recombinant proteins, protein purification, and their structural and functional characterisation, the latter referring mainly to enzymatic activity.
Knowledge and understanding - at the end of the course, students will know the theory underlying main biochemical laboratory techniques and basic techniques for the manipulation of recombinant DNA.
Ability to apply knowledge and understanding - at the end of the course students will be able to apply the knowledge acquired in choosing experimental approaches for DNA cloning, production, purification and characterization of proteins. This knowledge will also be applied in subsequent courses, in particular in practical course of integrated biology (Laboratorio integrato di biologia – LIB).
Autonomy of judgment - at the end of the course, students will be able to develop a protocol for cloning of plasmidic DNA, production of recombinant protein, protein purification and characterization.
Communication skills - at the end of the course, students are expected to acquire and to use adequate scientific terminology.
Learning skills - at the end of the course, students should be able to understand and recognise the methodologies learnt in different contexts (e.g. in scientific articles).
.
Contents
-
Preparative techniques for protein extraction and enrichment
-
Electrophoretic and immunochemistry techniques
-
Techniques for assaying protein and enzyme activity
4). Preparative techniques for protein purification
-
Biophysical techniques for conformational analysis of proteins
-
Recombinant DNA methods for cloning and production of recombinant proteins
Detailed program
1. Preparative techniques for protein extraction and enrichment. Centrifugation and ultrafiltration techniques; Ammonium sulfate precipitation and fractionation; Cell lysis and fractional centrifugation techniques.
2. Electrophoretic and immunochemical techniques. Electrophoresis in native and denaturing conditions (SDS-PAGE); Isoelectrophoresis (IEF) and two-dimensional electrophoresis (2D-PAGE); Western blotting; Introduction to immunochemical techniques; Immunoprecipitation, ELISA
3. Techniques for protein and enzyme activity assay. Protein concentration assay; Enzyme activity' assays; Purification table.
4. Preparative techniques for protein purification. Introduction to chromatographic techniques; Introduction to chromatographic techniques; Molecular exclusion chromatography; Ion exchange chromatography; Hydrophobic interaction and reverse phase chromatography; Affinity chromatography; HPLC and FPLC; Evaluating the progress of a purification.
5. Biophysical techniques for protein conformational analysis. Introduction to UV-vis spectrophotometry and absorption; Circular dichroism spectroscopy; Spectrofluorimetry; Fluorescence resonance energy transfer (FRET) techniques.
6. Recombinant DNA methods for cloning and production of recombinant proteins. Methods for the production of recombinant proteins; Restriction and ligation enzymes; Choices of cloning vectors and hosts; DNA amplification (polymerase chain reaction); Plasmid DNA extraction methods; DNA electrophoresis; Introduction to sequencing techniques.
Prerequisites
Knowledge of basic concepts of physics and general and organic chemistry is required. Most relevant physicochemical principles and biochemistry concepts will be briefly stated or recalled at the beginning of class.
Teaching form
The course consists of 24 lessons (6 ECTS) delivered in a mixed mode: conventional "lecture-based", in the presence of students, and "interactive", with active participation and involvement of students in the analysis and interpretation of experimental methods from protocol books; scientific methodology journals; scientific articles.
Each lesson will be supported by PowerPoint presentations, videos and analyses of experimental methods. New topics of study may be introduced based on the requests of the participating students.
Depending on the number and wishes of the students, group work can be carried out to analyse experimental methods and their complementarity.
Textbook and teaching resource
Textbooks:
- K. Wilson & J. Walker (2010). Principles and Techniques of Biochemistry and Molecular Biology.
- M. C. Bonaccorsi di Patti, R. Contestabile, M. L. Di Salvo “Metodologie Biochimiche” Casa Editrice Ambrosiana, 2012
Teaching materials available on the course Moodle page (http://elearning.unimib.it/).:
- Lecture slides
- Exam questions and exercises
- Scientific articles selected by the teacher.
Semester
Second semester
Assessment method
Written + oral examination.
Written Exam (60 min): consists of multiple choice questions and exercises.
Oral examination (approx. 20 min): consists of two to three questions covering the entire syllabus.
Both exams assess the theoretical knowledge acquired, the ability to interpret experimental data and to establish complementary relationships between different experimental techniques and approaches. In addition, presentation skills and the use of scientifically and technically appropriate language will be assessed.
The grade for both the written and oral exams will be out of thirty. The final mark will be the average of the two marks.
No interim exams are scheduled.
Office hours
On demand, by mail to stefania.brocca@unimib.it
Sustainable Development Goals
Staff
-
Stefania Brocca
