Course Syllabus
Obiettivi
Questo insegnamento si propone di fornire agli studenti una conoscenza di base delle più comuni tecniche biochimiche e del DNA ricombinante. Il corso mira inoltre a illustrare la complementarietà tra le strategie di clonaggio, la produzione, purificazione e caratterizzazione (strutturale e funzionale, con particolare enfasi sull'attività enzimatica) delle proteine ricombinanti.
Conoscenza e capacità di comprensione - al termine dell'insegnamento lo studente dovrà conoscere i principi teorici delle principali tecniche di laboratorio biochimico e di tecniche di base per la manipolazione del DNA ricombinante.
Capacità di applicare conoscenza e comprensione - al termine dell'insegnamento lo studente dovrà essere in grado di applicare le conoscenze acquisite nella scelta di un approccio sperimentale per il clonaggio di DNA, la produzione, purificazione e caratterizzazione di proteine; tali conoscenze verranno anche applicate nei corsi successivi, in particolare nel corso di Laboratorio Integrato di Biologia (LIB).
Autonomia di giudizio - al termine dell’insegnamento, lo studente sarà in grado di riconoscere e comprendere i passaggi principali di un protocollo di clonaggio di DNA plasmidico, produzione di proteine ricombinanti, purificazione e caratterizzazione strutturale di proteine.
Abilità comunicative - alla fine dell'insegnamento lo studente avrà acquisito un vocabolario tecnico-scientifico adeguato e saprà esporre con proprietà di linguaggio gli argomenti trattati nel corso.
Capacità di apprendimento - alla fine dell'insegnamento è atteso che lo studente sia in grado di comprendere e riconoscere le metodologie apprese in diversi contesti (ad esempio, in articoli scientifici, relazioni e protocolli sperimentali).
Contenuti sintetici
- Metodi del DNA ricombinante per il clonaggio e la produzione di proteine ricombinanti
- Tecniche preparative per l'estrazione e l'arricchimento di proteine
- Tecniche elettroforetiche ed immunochimiche
- Tecniche per il dosaggio delle proteine e dell'attività enzimatica
- Tecniche preparative per la purificazione di proteine
- Alcune tecniche spettroscopiche per l'analisi conformazionale delle proteine
Programma esteso
1. Metodi del DNA ricombinante, per il clonaggio e la produzione di proteine ricombinanti. Strategia di produzione di proteine ricombinanti; Clonaggio genico con enzimi di restrizione e di ligazione; Scelte di vettori e di ospiti di clonaggio; Amplificazione del DNA (polymerase chain reaction); Metodi di estrazione del DNA plasmidico; Elettroforesi del DNA; Elettroforesi capillare; Sequenziamento del DNA con metodo di Sanger.
2. Tecniche preparative per l'estrazione e l'arricchimento di proteine. Tecniche centrifugative e di ultrafiltrazione; Precipitazione e frazionamento in ammonio solfato; Tecniche di lisi cellulare e centrifugazione frazionata.
3. Tecniche elettroforetiche ed immunochimiche. Elettroforesi in condizioni native e denaturanti (SDS-PAGE); Western blotting; Introduzione alle tecniche immunochimiche; Immunoprecipitazione, ELISA
4. Tecniche per il dosaggio delle proteine e dell'attività enzimatica. Dosaggio della concentrazione proteica; Saggi di attività enzimatica; Tabella di purificazione.
5. Tecniche preparative per la purificazione di proteine. Introduzione alle tecniche cromatografiche; Introduzione alle tecniche cromatografiche; Cromatografia di esclusione molecolare; Cromatografia a scambio ionico; Cromatografia di interazione idrofobica e reverse phase; Cromatografia di affinità; HPLC ed FPLC; Valutare l'andamento di una purificazione.
6. Tecniche biofisiche per l'analisi conformazionale delle proteine. Introduzione alla spettrofotometria e assorbimento in UV-vis; Spettroscopia di dicroismo circolare; Spettrofluorimetria; Tecniche di fluorescence resonance energy transfer (FRET).
Prerequisiti
È necessaria la conoscenza di concetti basilari di fisica, chimica generale ed organica. I principi chimico-fisici e le nozioni di biochimica essenziali per la comprensione delle diverse metodologie verranno esposti brevemente o ricapitolati all’inizio delle lezioni.
Modalità didattica
L'insegnamento prevede 24 lezioni (6 CFU) che si svolgeranno in modalità mista. Le lezioni saranno sia 'erogative' (convenzionali, in presenza) sia 'interattive', promuovendo la partecipazione attiva e il coinvolgimento degli studenti nell'analisi e interpretazione di metodi sperimentali. Il materiale di studio includerà protocol book, riviste di metodologia scientifica e articoli scientifici.
Ciascuna lezione sarà supportata da presentazioni PowerPoint, video e analisi di metodi sperimentali. In base alle richieste degli studenti frequentanti, potranno essere introdotti nuovi argomenti di studio.
In base al numero e alle richieste degli studenti frequentanti, potranno essere svolti lavori di gruppo, volti all’analisi di metodi sperimentali ed alla loro complementarietà.
Materiale didattico
Libri di testo:
- K. Wilson & J. Walker (2000) “Biochimica e Biologia Molecolare” Cortina, 2006
- M. C. Bonaccorsi di Patti, R. Contestabile, M. L. Di Salvo “Metodologie Biochimiche” Casa Editrice Ambrosiana, 2012
Materiale didattico reperibile sulla pagina Moodle dell’insegnamento:
- Slide delle lezioni
- Domande ed esercizi d'esame
- Articoli scientifici selezionati dal docente
Periodo di erogazione dell'insegnamento
Secondo semestre
Modalità di verifica del profitto e valutazione
Esame scritto + orale.
L'esame consiste in una prova scritta (60 minuti) e una prova orale (circa 20 minuti).
La prova scritta comprende quesiti a risposta multipla ed esercizi, con un punteggio massimo di 15 punti. Per essere ammessi alla prova orale, è necessario ottenere un minimo di 10 punti.
La prova orale si basa su due o tre domande relative all'intero programma, con un punteggio massimo di 15 punti.
Il voto finale è la somma dei punteggi ottenuti nella prova scritta e in quella orale. La soglia di sufficienza per il superamento dell'esame è fissata a 18 punti.
Entrambe le prove mirano a valutare le conoscenze teoriche, la capacità di interpretare dati sperimentali e di stabilire relazioni tra tecniche e approcci sperimentali diversi. Verranno inoltre valutate le capacità espositive e l'uso di un linguaggio scientificamente e tecnicamente appropriato.
Non sono previste prove in itinere.
Orario di ricevimento
Su appuntamento, per mail a stefania.brocca@unimib.it
Sustainable Development Goals
Aims
The primary objective of this course is to provide students with a basic understanding of the most common biochemical and recombinant DNA techniques. It also aims to illustrate the complementarity between cloning strategies, the production, purification, and characterization (structural and functional, with particular emphasis on enzymatic activity) of recombinant proteins.
Knowledge and understanding - At the end of the course, the student will be familiar with the theoretical principles of the main biochemical laboratory techniques and basic recombinant DNA manipulation techniques.
Applying knowledge and understanding - At the end of the course, the student will be able to apply the acquired knowledge in choosing an experimental approach for DNA cloning, protein production, purification, and characterization. This knowledge will also be applied in subsequent courses, particularly in the Integrated Biology Laboratory (LIB) course.
Making judgments - At the end of the course, the student will be able to recognize and understand the main steps of a plasmid DNA cloning protocol, recombinant protein production, purification, and structural characterization of proteins.
Communication skills - At the end of the course, the student will have acquired an adequate technical-scientific vocabulary and will be able to properly explain the topics covered in the course.
Learning skills - At the end of the course, students are expected to be able to understand and apply the learned methodologies in different contexts (e.g., in scientific articles, experimental reports and protocols).
Contents
- Recombinant DNA methods for cloning and producing recombinant proteins.
- Preparative techniques for protein extraction and enrichment.
- Electrophoretic and immunochemical techniques.
- Techniques for protein and enzymatic activity assays.
- Preparative techniques for protein purification.
- Selected spectroscopic techniques for protein conformational analysis.
Detailed program
1. Recombinant DNA methods for cloning and producing recombinant proteins. Recombinant protein production strategy; Gene cloning with restriction and ligation enzymes; Choice of vectors and cloning hosts; DNA amplification (polymerase chain reaction); Plasmid DNA extraction methods; DNA electrophoresis; Capillary electrophoresis; DNA sequencing with Sanger's method.
2. Preparative techniques for protein extraction and enrichment. Centrifugation and ultrafiltration techniques; Ammonium sulfate precipitation and fractionation; Cell lysis and differential centrifugation techniques.
3. Electrophoretic and immunochemical techniques. Electrophoresis under native and denaturing conditions (SDS-PAGE); Western blotting; Introduction to immunochemical techniques; Immunoprecipitation, ELISA.
4. Techniques for protein and enzymatic activity assays. Protein concentration assay; Enzymatic activity assays; Purification table.
5. Preparative techniques for protein purification. Introduction to chromatographic techniques; Size exclusion chromatography; Ion exchange chromatography; Hydrophobic interaction and reverse phase chromatography; Affinity chromatography; HPLC and FPLC; Evaluating purification progress.
6. Biophysical techniques for protein conformational analysis. Introduction to spectrophotometry and UV-Vis absorption; Circular dichroism spectroscopy; Spectrofluorimetry; Fluorescence resonance energy transfer (FRET) techniques.
Prerequisites
Basic knowledge of physics, general, and organic chemistry is required. The physico-chemical principles and essential biochemical concepts for understanding the different methodologies will be briefly explained or reviewed at the beginning of the lessons.
Teaching form
The course comprises 24 lessons (6 ETCF) delivered in a blended format. These lessons will be both 'traditional' (conventional, in-person delivery) and 'interactive,' fostering active student participation in the analysis and interpretation of experimental methods. Learning materials will include protocol books, scientific methodology journals, and research articles.
Each lesson will be supported by PowerPoint presentations, videos, and analysis of experimental methods. Based on the requests of attending students, new study topics may be introduced.
Depending on the number and requests of attending students, group work aimed at analyzing experimental methods and their complementarity may be carried out.
Textbook and teaching resource
Textbooks:
- K. Wilson & J. Walker (2010). Principles and Techniques of Biochemistry and Molecular Biology.
- M. C. Bonaccorsi di Patti, R. Contestabile, M. L. Di Salvo “Metodologie Biochimiche” Casa Editrice Ambrosiana, 2012
**Teaching materials **available on the course Moodle page (http://elearning.unimib.it/).:
- Lecture slides
- Exam questions and exercises
- Scientific articles selected by the teacher.
Semester
Second semester
Assessment method
Written + oral examination.
The exam consists of a written test (60 minutes) and an oral examination (approx. 20 minutes).
The written test includes multiple-choice questions and exercises, with a maximum score of 15 points. To be admitted to the oral examination, a minimum score of 10 points is required.
The oral examination will consist of two to three questions covering the entire program, with a maximum score of 15 points.
The final grade is the sum of the scores obtained in the written and oral tests. The passing threshold for the exam is set at 18 points.
Both assessments aim to evaluate theoretical knowledge, the ability to interpret experimental data, and to establish relationships between different techniques and experimental approaches. Communication skills and the use of scientifically and technically appropriate language will also be assessed.
There are no in-progress tests.
Office hours
By appointment, via email to stefania.brocca@unimib.it
Sustainable Development Goals
Staff
-
Stefania Brocca
