Course Syllabus
Obiettivi
Obiettivo di questo corso è fornire agli studenti una conoscenza di base delle più comuni tecniche in uso nel laboratorio biochimico. Il corso mira inoltre a sviluppare un senso critico nella scelta di strategie per la purificazione di proteine e di metodi per il dosaggio di attività enzimatica e per l’espressione di proteine ricombinanti
1. Conoscenza e capacità di comprensione - al termine dell'insegnamento lo studente dovrà conoscere la teoria alla base delle principali tecniche utilizzate nel laboratorio biochimico
2. Capacità di applicare conoscenza e comprensione - al termine dell'insegnamento lo studente dovrà essere in grado di applicare le conoscenze acquisite nella scelta di un approccio sperimentale per la purificazione e caratterizzazione di proteine; tali conoscenze verranno anche applicate nei corsi successivi, in particolare nel corso di “laboratorio integrato di biologia”
3. Autonomia di giudizio - al termine del corso, lo studente sarà in grado di mettere a punto un protocollo di purificazione di proteine e di operare una scelta tra i diversi metodi di caratterizzazione.
4. Abilità comunicative - alla fine dell'insegnamento lo studente avrà acquisito una terminologia scientifica adeguata e saprà esporre con proprietà di linguaggio gli argomenti trattati nel corso.
5. Capacità di apprendimento - alla fine dell'insegnamento lo studente sarà in grado di comprendere e valutare criticamente l’uso delle metodologie riportate nella letteratura scientifica.
Contenuti sintetici
Metodi per la rottura di cellule; centrifugazioni; spettroscopia UV-VIS; spettrofluorimetria; metodi di dosaggio della concentrazione proteica e dell’attività enzimatica; cromatografie; strategie per la purificazione di proteine; elettroforesi; produzione di proteine ricombinanti; tecniche immunochimiche; tecniche radioisotopiche; tecniche manometriche; metodi per l’analisi della struttura primaria di proteine.
Programma esteso
Metodi per la rottura di cellule – tamponi e stabilità delle proteine; metodi per la rottura delle cellule; salting out; dialisi
Centrifugazioni – principi generali; centrifugazione differenziale; centrifugazione in gradiente di densità; elutriazione
Spettroscopia UV-VIS spettrofluorimetria
Metodi di dosaggio della concentrazione proteica e dell’attività enzimatica – metodo di Bradford e BCA; dosaggi di attività enzimatica
Cromatografie – principi generali; gel filtrazione; cromatografia a scambio ionico; cromatofocusing; cromatografia in fase inversa; cromatografia idrofobica; cromatografia di affinità
Strategie per la purificazione di proteine
Elettroforesi – principi generali; SDS-PAGE; elettroforesi nativa; isoelettrofocalizzazione; elettroforesi bidimensionale
Produzione di proteine ricombinanti – vettori per la produzione di proteine ricombinanti “taggate”; purificazione e rimozione del tag
Tecniche immunochimiche – immunoprecipitazione; western blotting; ELISA; RIA; immunoistochimica
Tecniche radioisotopiche – radioattività e radioisotopi uilizzati nel laboratorio biochimico; contatore di Geiger-Muller; conteggio in scintillazione; autoradiografia
Tecniche manometriche – elettrodi di Clark e di Rank
Metodi per l’analisi della struttura primaria delle proteine – aminoacido analisi; degradazione di Edman; spettrometria di massa
Prerequisiti
E’ necessaria la conoscenza delle basi della fisica, della chimica generale ed organica e della biochimica. I principi chimico-fisici e le nozioni di biochimica essenziali per la comprensione delle diverse metodologie verranno riassunti all’inizio della lezione.
Modalità didattica
Lezioni frontali con presentazione powerpoint; video; lezioni partecipate (discussione di dati sperimentali)
Materiale didattico
testi consigliati:
Wilson&Walker "Biochimica e Biologia molecolare" Ed. Cortina (2019); Bonaccorsi, Contestabile, Di Salvo “Metodologie biochimiche” CEA
slides disponibili sulla piattaforma Moodle
Periodo di erogazione dell'insegnamento
Secondo semestre
Modalità di verifica del profitto e valutazione
Esame orale: attraverso la prova orale ci si propone di valutare le conoscenze acquisite dallo studente e la sua capacità di illustrarle in modo coerente; viene valutata anche la capacità di discutere dati sperimentali; consiste in 3-4 domande. Non sono previste prove in itinere.
Orario di ricevimento
su richiesta per e-mail (paola.fusi@unimib.it)
Aims
The aim of the course is to provide students with a basic knowledge of the most important techniques in use in the biochemical laboratory. Students are encouraged to develop a critical approach in the choice of different strategies in protein purification and enzyme activity assays.
1. Knowledge and understanding - students will learn the theory underlying the most common biochemical techniques, as well as the basis of the most important molecular and cell biology techniques. A particular emphasis will be set on the general principles underlying recombinant protein production, purification and characterization
2. Applying knowledge and understanding - at the end of the course students will be able to apply the knowledge acquired to the choice of the different experimental approaches in protein purification and characterization; this knowledge will also be essential in other courses, particularly in the “Integrated biological laboratory” course
3. Making judgements – at the end of the course students will be able to devise a protein purification protocol and to choose among the different characterization methods
4. Communication skills - students will acquire a specific scientific language and the ability to orally describe the topics discussed in the course
5. Learning skills - this course will provide students with the ability to understand and critically evaluate the experimental methods described in the scientific literature.
Contents
Cell disruption methods; centrifugation; UV-VIS spectroscopy and spectrofluorimetry; protein concentration and enzyme activity assays; chromatographies; strategies in protein purification; electrophoresis; production of recombinant proteins; immunochemical techniques; radioisotopic techniques; manometry; an overview of methods for primary structure analysis.
Detailed program
Cell disruption methods – Buffers and proteins stability; soft, medium and hard methods for cells disruption; salting out; dialysis
Centrifugation – general principles; differential centrifugation; density gradient centrifugation; elutriation
UV-VIS spectroscopy and spectrofluorimetry
Protein concentration and enzyme activity assay – Bradford and BCA assays; experimental setting for enzyme activity assays
Chromatography – general principles; gel filtration; ion-exchange chromatography; hydrophobic chromatography; chromatofocusing; reverse phase chromatography; affinity chromatography
Strategies in protein purification
Electrophoresis – general principles; SDS-PAGE; native electrophoresis; isoelectrofocusing; 2D electrophoresis
Production of recombinant proteins – vectors for the expression of tagged recombinant proteins; purification of tagged proteins and tag removal
Immunochemical techniques – immunoprecipitation; western blotting; ELISA; RIA; immunocytochemistry
Radioisotopic techniques – radioactivity; radioisotopes in use in the biochemical laboratory; Geiger-Muller counter; scintillation counter; autoradiography
Manometry – Clark and Rank electrodes
Methods for proteins primary structure analysis – aminoacid analysis; Edman degradation; mass spectrometry
Prerequisites
A basic knowledge of general and organic chemistry, physics and biochemistry is essential. The essential physico-chemical principles and biochemistry topics will be reviewed before addressing each method.
Teaching form
Front lectures based on powerpoint presentations; videos; active learning (discussion of experimental data)
Textbook and teaching resource
Suggested textbook:
Wilson&Walker "Biochimica e Biologia molecolare" Ed. Cortina (2019);Bonaccorsi, Contestabile, Di Salvo “Metodologie biochimiche” CEA
slides are available at Moodle site
Semester
Second semester
Assessment method
Oral examination: The oral examination is aimed at assessing the student's ability to illustrate coherently the course main topics and to discuss experimental data. It consists of 3-4 general questions.
No in itinere evaluations are scheduled.
Office hours
upon request (paola.fusi@unimib.it)
Students' opinion
Bibliography
Staff
- Paola Alessandra Fusi