Syllabus del corso
Obiettivi
L’insegnamento si articola in due moduli e si propone di fornire conoscenze avanzate relative all’organizzazione della cromatina ad alcuni processi coinvolti nel controllo dell’espressione genica. Particolare attenzione verrà rivolta all’aspetto metodologico approfondendo possibili applicazioni nel campo delle biotecnologie.
Conoscenza e capacità di comprensione.
Lo studente conoscerà l’organizzazione della cromatina, i meccanismi molecolari di regolazione epigenetica e sarà in grado di comprendere i meccanismi di controllo dell’espressione genica in eucarioti. Apprenderà l’organizzazione di genomi complessi, i metodi di analisi degli stessi e dei relativi trascrittomi.
Capacità di applicare conoscenza e comprensione.
Lo studente sarà in grado di applicare le conoscenze acquisite nei successivi insegnamenti ed in esperienze di laboratorio e di utilizzare la capacità di comprensione ai fini di successive attività di studio e/o di ricerca.
Autonomia di giudizio.
Lo studente sarà in grado di elaborare quanto appreso e saprà riconoscere le situazioni e i problemi in cui le conoscenze apprese possano essere utilizzate.
Abilità comunicative.
Alla fine dell'insegnamento, lo studente saprà descrivere con proprietà di linguaggio e sicurezza di esposizione argomenti inerenti la biologia molecolare e le sue applicazioni.
Capacità di apprendimento.
Alla fine dell'insegnamento, lo studente sarà in grado di consultare la letteratura sugli argomenti trattati e saprà analizzare, applicare, integrare e collegare le conoscenze acquisite con quanto verrà appreso in insegnamenti correlati.
Contenuti sintetici
Analisi dell’espressione genica e identificazione di geni differenzialmente espressi.
Organizzazione della cromatina ed espressione genica.
Tecniche di analisi della cromatina a bassa e alta risoluzione.
Gene targeting in mammiferi, animali transgenici.
Meccanismi di silenziamento genico.
Tecniche di sequenziamento su larga scala.
Concetti di analisi dati di sequenziamento su larga scala.
Programma esteso
Modulo 1- Prof. Marina Vai
1. Analisi dell’espressione genica e identificazione di geni differenzialmente espressi. RT-PCR competitiva. Real Time PCR (Sybr green e sonde fluorescenti). Curve di melting. Real Time PCR quantitativa (relativa ed assoluta). Microarray a oligonucleotidi e a cDNA (spotting e fotolitografia, marcatura e disegno sperimentale), analisi dei dati (validazione e clustering). Alterazioni trascrizionali e localizzazione cromosomale. Analisi trascrizionali e applicazioni: nelle biotecnologie rosse (microarray-based diagnostic/prognostic tests), nelle biotecnologie verdi (miglioramento fragranza, colore e forma di cultivar di rosa).
2. Organizzazione della cromatina ed espressione genica. Struttura del nucleosoma. Modificazioni della cromatina. Codice istonico. Modificazioni istoniche e trascrizione. Complessi acetilasici (SAGA). Silencing, modello di assemblaggio della cromatina silente in lievito. Organizzazione telomeri lievito e uomo. Alterazioni nel silenziamento genico/nel remodeling della cromatina e patologie. Deacetilasi e cancro. Isole CpG e trascrizione. Metilazione del DNA e patologie (X fragile, sindrome di Rett).
3. Tecniche di analisi della cromatina a bassa e alta risoluzione. MSREs (Methylation-Sensitive Restriction Enzymes). Metodi basati sul trattamento con Bisolfito: Methylation-Specific PCR, Methyl-Light etc. Chromatin Immunoprecipitation (ChIP). ChIP on chips. Methylated DNA
Immunoprecipitation (MeDIP). DNA methylation arrays.
Modulo 2- Prof. Mattia Pelizzola
1. Espressione in eucarioti pluricellulari. Gene-targeting in mammiferi. Topi knock-out e knock- in e loro applicazioni per ricerca di base e applicata. Modificazioni mirate del genoma, zinc-finger nucleases, TALEN e CRISPR-Cas9.
2. Silenziamento genico post-trascrizionale: Oligonucleotidi antisenso, Ribozimi e RNA interferenti. Meccanismi molecolari del silenziamento da RNA interferenti, microRNA e short-hairpin RNA.
3. Organizzazione del genoma e metodologie di sequenziamento a larga scala: sequenziamento per sintesi di tipo Illumina, sequenziamento a Nanopori. Applicazioni delle metodologie di sequenziamento: trascrizione genica (RNA-seq), trascrizione genica in singole cellule (scRNA-seq), analisi del legame di fattori regolativi a DNA e cromatina, e di modificazioni della cromatina (ChIP-seq).
4. Concetti di analisi di dati di sequenziamento a larga scala: la profondità di sequenziamento, controlli di qualità post-sequenziamento, allineamento dei dati grezzi, normalizzazione tra campioni, espressione assoluta e differenziale, siti di interazione di fattori a DNA e cromatina e modificazioni della cromatina.
5. Il ciclo vitale dell’RNA: regolazione co- e post-trascrizionale dell’espressione genica, sintesi di RNA nascente, processamento dell’RNA prematuro, degradazione dell’RNA maturo. Il ruolo della RNA Polimerasi 2.
6. Modificazioni epitrascrizionali dell’RNA: modificazioni dell’RNA non-codificante e messaggero, fattori che aggiungono/rimuovono/decodificano le modificazioni dell’RNA. Applicazioni biotecnologiche nella produzione di vaccini a RNA e nello sviluppo di farmaci anti-tumorali.
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Prerequisiti
Prerequisiti: nozioni fondamentali di Biologia Molecolare.
Propedeuticità: nessuna.
Modalità didattica
28 lezioni frontali da 2 ore così strutturate:
• una parte in modalità erogativa (didattica erogativa, DE) focalizzata sulla presentazione-illustrazione di contenuti, concetti e principi scientifici
• una parte in modalità interattiva (didattica interattiva, DI) che prevede interventi didattici integrativi e brevi interventi effettuati dai corsisti.
Tutte le attività sono svolte in presenza.
L'insegnamento è tenuto in lingua italiana.
Materiale didattico
Slide e articoli scientifici reperibili sulla piattaforma e-learning dell'insegnamento.
Testi consigliati:
-J.D. Watson et al. “Biologia molecolare del gene” Zanichelli
- G. Capranico et al. “Biologia Molecolare” EdiSES
- T.A. Brown “Biotecnologie molecolari” Zanichelli
- M. Romani “Epigenetica” Zanichelli
- M.H. Citterich et al. “Fondamenti di Bioinformatica” Zanichelli
Periodo di erogazione dell'insegnamento
Secondo semestre
Modalità di verifica del profitto e valutazione
Esame orale: discussione di un lavoro scientifico su uno degli argomenti trattati durante il corso valutando la capacità e l'analisi critica di interpretazione dei risultati. Segue un'interrogazione convenzionale sul programma svolto.
Orario di ricevimento
Ricevimento. Su appuntamento telefonico o via e-mail.
Sustainable Development Goals
Aims
The course is organized in two modules dealing with chromatin organization and some of the processes involved in the control of gene expression. Particular emphasis will be devoted to methods and biotechnological applications.
Knowledge and understanding.
Students will learn chromatin organization and the molecular mechanisms of gene expression and epigenetic regulation in eukaryotic organisms. They will learn about the organization of complex genomes, the methods of their analysis, as well as, of the corresponding trascrittome.
Applying knowledge and understanding.
Students will be able to apply the acquired knowledge in other courses and in laboratory experiences and to use the comprehension skill in subsequent studies and/or research activities.
Making judgments.
Students will be able to process what they have learned and be able to recognize situations and
problems in which the acquired knowledge can be used.
Communication skills.
At the end of the course, students will be able to express themselves appropriately in the description of issues related to the molecular biology and its applications by using language properties, as well as, self-confidence.
Learning skills
At the end of the course, students will be able to survey the scientific literature related to the topics covered and will be able to analyze, apply and integrate the acquired knowledge with what learned in related courses.
Contents
Gene expression analysis and differential gene expression identification.
Chromatin organization and gene expression.
Low and high resolution analysis techniques for studying chromatin organization.
Gene targeting in mammals, transgenic animals.
Mechanisms of silencing (iRNA, ribozymes etc).
High-throughput sequencing methods.
Analysis of high-throughput sequencing data.
Detailed program
First module- Prof. Marina Vai
1. Gene expression analysis and differential gene expression identification. Competitive RT-PCR. Real Time PCR (sybr green and fluorescent probes). Melting curves. DNA arrays (oligos and cDNA): analysis and applications to Red Biotechnology (microarray-based diagnostic/prognostic tests) and Green Biotechnology (genomics approach to discover rose scent-related genes).
2. Chromatin organization and gene expression. The nucleosome. Chromatin modifications. The histone code. Histone modifications and transcription. The SAGA complex. Silencing: a model for silent chromatin assembly in yeast. Altered gene silencing/chromatin remodelling and disease. Deacetylases and cancer. CpG islands and transcription. DNA methylation in disease (fragile X, Rett syndrome).
3. Low and high resolution analysis techniques for studying chromatin organization. Methylation-sensitive restriction enzymes. Bisulfite-based methods: Methylation Specific PCR, Methyl-Light. Chromatin Immunoprecipitation (ChIP).ChIP on chips. Methylated DNA immunoprecipitation. DNA methylation arrays.
Second Module- Prof. Mattia Pelizzola
1. Expression in pluricellular eukaryotes. Transgenic animals. Knock-out and knock-in in mouse. Genome targeting and modification: Zinc-finger nucleases, TALEN and CRISPR-Cas9.
2. Gene expression silencing. Antisense oligonucleotides, ribozymes and interferent RNA. Molecular basis for RNA interference.
3.Genome organization and high-throughput sequencing methods: sequencing by synthesis via Illumina, sequencing by nanopores. Applications of high-throughput sequencing: gene expression profiling (RNA-seq), single cell expression profiling (scRNA-seq), binding of factors to DNA and chromatin, and modifications of chromatin (ChIP-seq).
4. Concepts of high-throughput sequencing data analysis: sequencing depth, quality controls, reads alignment, samples normalization, absolute and differential expression, identification of binding sites factors recognizing DNA and chromatin, calling of chromatin modifications.
5. The RNA life cycle: co- and post-transcriptional regulation of gene expression programs, synthesis of nascent RNA, processing of premature RNA, degradation of mature RNA, the role of RNA polymerase 2.
6. Epitranscriptional modifications of RNA: modifications of coding and non-coding RNAs, writers/erasers/readers of RNA modifications. Biotechnological applications: production of RNA vaccines and anti-cancer drugs.
Prerequisites
Background: basic notions of Molecular Biology.
Prerequisites: none
Teaching form
28 x 2 hours-lectures composed by:
• a section of delivered didactics (Didattica erogativa, DE) focused on the presentation-illustration of contents by the lecturer
• a section of interactive teaching (Didattica Interattiva, DI) including teaching interventions supplementary to delivered didactic activities and short interventions by trainees.
Didactic activities are conveyed by means of face-to-face lectures.
Teaching language: Italian.
Textbook and teaching resource
Selected scientific papers and slides will be available at the e-learning platform of the course
Recommended textbooks:
- J.D. Watson et al. “Biologia molecolare del gene” Zanichelli
- G. Capranico et al. “Biologia Molecolare” EdiSES
- T.A. Brown “Biotecnologie molecolari” Zanichelli
- M. Romani “Epigenetica” Zanichelli
- M.H. Citterich et al. “Fondamenti di Bioinformatica” Zanichelli
Semester
Second semester
Assessment method
Oral examination. Students will be asked to discuss a scientific paper on one of the topics covered during the course, followed by a conventional query on the course content. The ability to appropriately describe the scientific results, as well as their critical analysis will be positively evaluated.
Office hours
Contact. On demand, by telephone or e-mail request to the lecturers.
