Course Syllabus
Obiettivi
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Conoscenza e Comprensione
Gli studenti acquisiranno una solida comprensione delle tecniche avanzate basate sulla fluorescenza (ad es. tempo di vita della fluorescenza, anisotropia, FCS, DLS) e delle loro basi fisiche, con un focus sulla loro applicazione alla caratterizzazione di biomolecole e nanostrutture. -
Applicazione delle Conoscenze e Capacità di Comprensione
Gli studenti acquisiranno competenze pratiche nella progettazione sperimentale, calibrazione e analisi quantitativa utilizzando fluorescenza a tempo risolto, anisotropia di polarizzazione e spettroscopia di correlazione. Effettueranno misurazioni su sistemi proteina-colorante, nanoparticelle e mezzi biologici complessi. -
Autonomia di Giudizio
Gli studenti svilupperanno la capacità di valutare criticamente la qualità dei dati, interpretare i risultati in termini di modelli fotofisici e molecolari, e identificare le fonti di incertezza sperimentale. Valuteranno parametri fisici come costanti di legame, coefficienti di diffusione e stati di aggregazione. -
Abilità Comunicative
Gli studenti presenteranno in modo efficace dati sperimentali e interpretazioni scientifiche tramite relazioni tecniche e presentazioni orali, utilizzando una terminologia appropriata, rappresentazioni grafiche e ragionamento quantitativo. -
Capacità di Apprendimento
Gli studenti saranno in grado di approfondire in modo autonomo le proprie competenze in biofotonica e nelle tecniche sperimentali correlate, consultando la letteratura scientifica primaria e adattando le metodologie a nuovi contesti di ricerca.
Contenuti sintetici
Tecniche spettroscopiche applicate a biosistemi. Misura di tempi di vita di fluorescenza di tipici fluorofori per microscopia ottica. Anisotropia di fluorescenza. Diffusione dinamica di luce polarizzata e depolarizzata. Spettroscopia di correlazione di fluorescenza.
Programma esteso
Misura di tempi di vita di fluorescenza di tipici fluorofori per microscopia ottica. Coloranti in soluzione e miscele. Determinazione delle costanti di legame fluoroforo-proteina da misure dei tempi di vita. Dimensione di proteine e loro aggregazione mediante anisotropia di fluorescenza. Diffusione dinamica di luce polarizzata e depolarizzata. Effetti di temperatura e dei sali sulla diffusione di proteine. Cinetiche di aggregazione. Spettroscopia di correlazione di fluorescenza: calibrazione, misure al variare della potenza e concentrazione. Fotofisica della GFP. FCS di nanoparticelle d’oro. Misure di molecular crowding.
Prerequisiti
I contenuti dei corsi del Corso di Laurea Triennale in Fisica.
Raccomandati: insegnamento di Biofotonica del CdS Magistrale in Fisica e/o Esperimentazioni di Biofotonica del Corso di Laurea Triennale in Fisica.
Modalità didattica
Circa otto ore di didattica erogativa iniziale, per il resto didattica interattiva laboratoriale, con attività formative pratiche in presenza nei laboratori di ricerca del gruppo di Biofisica, stanze 4054-4052-4051.
Materiale didattico
C.R.Cantor and P.R.Schimmel, “Biophysical Chemistry”, W.H. Freeman & Co, 1980;
J.R.Lackowicz, “Principles of Fluorescence Spectroscopy”, Springer, 2006;
A.Diaspro, “Confocal and two photon microscopy: foundations, applications and advances” edited by Alberto Diaspro, Wiley, 2002.
Periodo di erogazione dell'insegnamento
I semestre.
Modalità di verifica del profitto e valutazione
Lo studente deve redigere in lingua inglese una relazione sugli esperimenti svolti, sulla quale verterà il colloquio orale finale.
Ogni studente dovrà inoltre preparare una breve presentazione (10 min) su uno degli esperimenti svolti durante il corso.
Il voto finale sarà determinato dalla valutazione della relazione, della conoscenza dei vari argomenti trattati, dell’analisi dei dati sperimentali e del comportamento tenuto durante tutto il corso in laboratorio.
Orario di ricevimento
Su appuntamento.
Sustainable Development Goals
Aims
- Knowledge and Understanding
Students will gain a solid understanding of advanced fluorescence-based techniques (e.g., fluorescence lifetime, anisotropy, FCS, DLS) and their physical foundations, with focus on their application to the characterization of biomolecules and nanostructures. - Applying Knowledge and Understanding
Students will acquire practical skills in experimental design, calibration, and quantitative analysis using time-resolved fluorescence, polarization anisotropy, and correlation spectroscopy. They will conduct measurements on protein–dye systems, nanoparticles, and complex biological media. - Making Judgements
Students will develop the ability to critically assess data quality, interpret results in terms of photophysical and molecular models, and identify sources of experimental uncertainty. They will evaluate physical parameters such as binding constants, diffusion coefficients, and aggregation states. - Communication Skills
Students will effectively present experimental data and scientific interpretations through technical reports and oral presentations, using appropriate terminology, graphical representation, and quantitative reasoning. - Learning Skills
Students will be able to independently deepen their expertise in biophotonics and related experimental techniques, consulting primary scientific literature and adapting methodologies to novel research contexts.
Contents
Time-resolved spectroscopic techniques applied to biosystems. Fluorescence lifetimes of typical fluorophores used in optical microscopy. Fluorescence anisotropy. Polarized and depolarized dynamic light scattering. Fluorescence correlation spectroscopy.
Detailed program
Fluorescence lifetimes measurements of typical fluorophores used in optical microscopy. Dyes in solution and mixtures of dyes. Fluorophore-protein binding constant evaluation from lifetimes measurements. Proteins size and aggregation studies by means of fluorescence polarization anisotropy. Polarized and depolarized dynamic light scattering. Temperature and salt concentration effects on protein diffusion dynamics. Aggregation kinetics. Fluorescence correlation spectroscopy (FCS): calibration of the optical setup, experiments versus excitation power and concentration. Green Fluorescent Protein photophysics. Gold nanoparticles FCS. Molecular crowding experiments.
Prerequisites
The topics covered in the different courses of the Bachelor Degree in Physics.
Recommended: the Biophotonics course of the Master Degree in Physics and/or the Experiments of Biophotonics course of the Bachelor Degree in Physics.
Teaching form
Approximately eight hours of initial instructional teaching, followed by interactive laboratory teaching, with practical training activities conducted in person in the research laboratories of the Biophysics group, rooms 4054-4052-4051.
Textbook and teaching resource
C.R.Cantor and P.R.Schimmel, “Biophysical Chemistry”, W.H. Freeman & Co, 1980;
J.R.Lackowicz, “Principles of Fluorescence Spectroscopy”, Springer, 2006;
A.Diaspro, “Confocal and two photon microscopy: foundations, applications and advances” edited by Alberto Diaspro, Wiley, 2002.
Semester
I semester.
Assessment method
Students are required to write a report in English describing the experiments performed and it will be the focus of the final oral examination.
Each student will also have to prepare a short presentation (10 min) on one of the experiments carried out during the course.
The final grade will be determined by the evaluation of the report, of the knowledge of the different topics covered in the lab, of the experimental data analysis and of the student’s behavior throughout the course in the laboratory.
Office hours
By appointment.
