Course Syllabus

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Il corso fornisce conoscenze teoriche e formazione pratica su alcune tecniche di biologia molecolare rilevanti per la ricerca medica.
Alla fine del corso pratico, lo studente dovrà essere in grado di:
Comprendere le basi teorico-pratiche dell'isolamento degli acidi nucleici
Padroneggiare il principio della retrotrascrizione
Pianificare e allestire una reazione di PCR
Applicare tecniche di analisi elettroforetica
Analizzare e interpretare i risultati sperimentali

Introduzione alle applicazioni biotecnologiche in medicina.
Il corso offre un'esperienza pratica incentrata sul workflow completo dell'analisi dell'espressione genica cellulare (RT-PCR). Gli studenti seguiranno passo dopo passo il percorso molecolare che porta dall'estrazione dell'RNA alla visualizzazione del prodotto genico. Il percorso si sviluppa in due fasi laboratoriali correlate: Fase 1: Estrazione e purificazione dell'RNA totale, misurazione quantitativa e qualitativa tramite spettrofotometria (Nanodrop) e reazione di retrotrascrizione per la sintesi del cDNA. Fase 2: Calcolo e preparazione dei campioni per la PCR, programmazione del termociclatore, preparazione del gel di agarosio ed elettroforesi per la separazione e identificazione dei frammenti amplificati, seguita da analisi dei risultati ottenuti.

FASE 1 – Estrazione dell'RNA totale e Retrotrascrizione
La prima fase è dedicata all'isolamento dell'RNA e alla sua conversione in cDNA, ponendo particolare attenzione alla prevenzione della degradazione da RNasi.
• Introduzione teorica: Il dogma centrale della biologia, le differenze chimico-strutturali tra DNA e RNA, il workflow sperimentale e le norme di sicurezza RNase-free.
• Estrazione dell'RNA: Lisi cellulare, rimozione del DNA genomico (gDNA), purificazione su colonna di silice con digestione enzimatica on-column (DNasi I) ed eluizione.
• Controllo qualità: Quantificazione dell'RNA estratto al Nanodrop e valutazione della purezza tramite i rapporti di assorbanza A260/280 e A260/230.
• Retrotrascrizione (RT): Allestimento delle reazioni con il kit LunaScript RT SuperMix o similare per sintetizzare il cDNA, preparando in parallelo il controllo negativo (RT-).

FASE 2 – Amplificazione tramite PCR ed Elettroforesi
La seconda fase si focalizza sull'amplificazione mirata del gene (es. GAPDH) e sulla separazione fisica dei frammenti biologici per la loro successiva visualizzazione.
• Allestimento della PCR: Ripasso guidato del workflow, calcolo dei volumi e preparazione di una Master Mix comune (Taq polimerasi, primer forward/reverse per GAPDH, dNTPs e tampone).
• Amplificazione termica: Aliquotazione della mix, aggiunta dei templati (cDNA, controlli RT-, positivi e negativi) ed esecuzione dei cicli termici (denaturazione, annealing ed estensione).
• Preparazione del gel: Diluizione del tampone TAE da 50X a 1X, fusione dell'agarosio in microonde (gel all'1.5% w/v) e addizione del colorante intercalante sicuro EuroSafe.
• Corsa elettroforetica e analisi: Caricamento dei campioni e del DNA Ladder, migrazione elettroforetica e visualizzazione dei risultati per verificare la banda attesa.

Per frequentare attivamente il laboratorio e comprendere le tappe del workflow sperimentale, si raccomanda il possesso dei seguenti requisiti conoscitivi e teorici:
Conoscenze teoriche di Biologia Molecolare e Genetica: Comprensione approfondita del Dogma Centrale della Biologia (flusso dell'informazione genica da DNA a RNA fino alla sintesi proteica).
Biochimica degli Acidi Nucleici: Nozioni sulle strutture chimiche differenziali dei nucleotidi costituenti il DNA e l'RNA.
Principi di base delle biotecnologie: Conoscenza teorica del funzionamento della Reazione a Catena della Polimerasi (fasi di denaturazione, annealing ed estensione) e della separazione delle molecole mediante carica ed effetto setaccio in un campo elettrico (elettroforesi).
Familiarità fondamentale con i concetti di concentrazione molecolare, soluzioni stock, soluzioni di lavoro e calcoli di diluizione lineare.

Attività di laboratorio per un totale di 12 ore svolte in modalità interattiva in presenza

Saranno messe a disposizione le diapositive introduttive e i protocolli utilizzati durante lo svolgimento dell'esercitazione.

Primo semestre

Gli argomenti costituiranno parte della prova orale finale, integrata con gli altri moduli del corso (vedi Syllabus del corso integrato).

Su appuntamento previa email al docente (emanuele.azzoni@unimib.it)

SALUTE E BENESSERE | ISTRUZIONE DI QUALITÁ
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The course provides theoretical knowledge and practical training on some widely used molecular biology techniques that are relevant for medical research.
The course provides theoretical knowledge and practical training on some molecular biology techniques relevant to medical research.
At the end of the practical course, students should be able to:
Understand the theoretical and practical basis of nucleic acid isolation
Master the principle of reverse transcription
Plan and set up a PCR reaction
Apply electrophoretic analysis techniques
Analyze and interpret experimental results

Introduction to biotechnology applications in medicine.
The course offers hands-on experience focusing on the complete workflow of cellular gene expression analysis (RT-PCR). Students will follow the molecular pathway, step by step, from RNA extraction to gene product visualization. The course is structured in two interrelated laboratory phases: Phase 1: Extraction and purification of total RNA, quantitative and qualitative measurement by spectrophotometry (Nanodrop), and reverse transcription reaction for cDNA synthesis. Phase 2: Calculation and preparation of samples for PCR, thermal cycler programming, agarose gel preparation, and electrophoresis for separation and identification of amplified fragments, followed by analysis of the results.

PHASE 1 – Total RNA Extraction and Reverse Transcription
The first phase is dedicated to RNA isolation and its conversion into cDNA, with particular attention paid to preventing degradation by RNases.
• Theoretical introduction: The central dogma of molecular biology, the chemical-structural differences between DNA and RNA, the experimental workflow, and RNase-free safety regulations.
• RNA extraction: Cell lysis, genomic DNA (gDNA) removal, purification on a silica column with on-column enzymatic digestion (DNase I), and elution.
• Quality control: Quantification of the extracted RNA using a Nanodrop and assessment of purity through A260/280 and A260/230 absorbance ratios.
• Reverse transcription (RT): Setting up reactions using the LunaScript RT SuperMix kit or similar to synthesize cDNA, while preparing the negative control (RT-) in parallel.

PHASE 2 – PCR Amplification and Electrophoresis The second phase focuses on the targeted amplification of the gene (e.g., GAPDH) and the physical separation of the biological fragments for subsequent visualization.
• PCR setup: Guided review of the workflow, volume calculations, and preparation of a common Master Mix (Taq polymerase, forward/reverse primers for GAPDH, dNTPs, and buffer).
• Thermal amplification: Aliquoting the mix, adding the templates (cDNA, RT- controls, positive and negative controls), and running the thermal cycles (denaturation, annealing, and extension).
• Gel preparation: Dilution of the TAE buffer from 50X to 1X, melting the agarose in a microwave (1.5% w/v gel), and adding the safe intercalating dye EuroSafe.
• Electrophoresis run and analysis: Loading the samples and the DNA Ladder, electrophoretic migration, and visualization of the results to verify the expected band.

To actively participate in the lab and understand the experimental workflow, the following knowledge and theoretical requirements are recommended:
Theoretical knowledge of Molecular Biology and Genetics: In-depth understanding of the Central Dogma of Biology (the flow of genetic information from DNA to RNA and protein synthesis).
Nucleic Acid Biochemistry: Knowledge of the differential chemical structures of the nucleotides that make up DNA and RNA.
Basic Principles of Biotechnology: Theoretical knowledge of the Polymerase Chain Reaction (denaturation, annealing, and extension steps) and the separation of molecules by charge and sieve effect in an electric field (electrophoresis).
Fundamental familiarity with the concepts of molecular concentration, stock solutions, working solutions, and linear dilution calculations.

Practical laboratory activities for a total of 12 hours carried out in interactive mode in person

The introductory slides and protocols used during the pratical training will be made available.

First semester

The topics will be part of the final integrated oral examination (further details are reported in the Syllabus of the entire course).

On appointment, by arrangement with the professor (emanuele.azzoni@unimib.it)

GOOD HEALTH AND WELL-BEING | QUALITY EDUCATION
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Key information

Field of research
BIOS-10/A
ECTS
1
Term
Annual
Activity type
Mandatory
Course Length (Hours)
12
Degree Course Type
6-year single cycle Master Degree
Language
English

Staff

    Teacher

  • Emanuele Azzoni
    Emanuele Azzoni

Enrolment methods

Manual enrolments

Sustainable Development Goals

GOOD HEALTH AND WELL-BEING - Ensure healthy lives and promote well-being for all at all ages
QUALITY EDUCATION - Ensure inclusive and equitable quality education and promote lifelong learning opportunities for all