Syllabus del corso
Obiettivi
L'insegnamento si propone di far acquisire agli studenti le conoscenze teorico-pratiche per l’applicazione di metodologie sperimentali di biochimica cellulare, mediante l’esecuzione di semplici esperimenti di espressione ed analisi di proteine in cellule di mammifero e la discussione dei risultati ottenuti.
Conoscenze e capacità di comprensione. Consolidare ed approfondire le conoscenze di base (teoriche, tecniche e metodologiche) già oggetto del corso frontale di biochimica.
Capacità di applicare conoscenze e comprensione. Essere in grado di eseguire ed interpretare correttamente i protocolli sperimentali di biochimica, riconoscerne gli aspetti salienti, raccogliere ed elaborare i dati sperimentali.
Autonomia di giudizio. Essere in grado di elaborare in modo critico il disegno sperimentale e i risultati ottenuti. Essere in grado di riconoscere i contesti in cui è opportuno applicare i metodi sperimentali eseguiti.
Abilità comunicative. Essere in grado di rielaborare i dati sperimentali ottenuti e descrivere i risultati conseguiti in un linguaggio scientifico appropriato.
Capacità di apprendimento. Essere in grado di interpretare correttamente protocolli sperimentali di biochimica in contesti diversi da quelli affrontati durante le esperienze pratiche di laboratorio.
Contenuti sintetici
1. Manipolazione e propagazione di cellule di mammifero in vitro;
2. Tecniche asettiche per la protezione dell’operatore, delle colture cellulari e dell’ambiente;
3. Curve di crescita cellulare e tempo di duplicazione in vitro;
4. Utilizzo di una tecnica che permette l’introduzione di acidi nucleici all’interno di cellule di mammifero, mediante una metodica chimica, in un processo definito "trasfezione”;
5. Quantizzazione proteica mediante saggio spettrofotometrici;
6. Analisi di attivita enzimatica mediante saggi spettrofotometrici;
7. Analisi di espressione proteica mediante microscopia a fluorescenza;
8. Analisi espressione proteica mediante tecnica western blot;
9. Analisi critica dei risultati ottenuti mediante l'utilizzo delle sopraindicate tecniche.
Programma esteso
1. Manipolazione e propagazione di cellule di topo e umane in vitro in particolare NIH3T3 immortalizzate e trasformate con l'oncogene K-Ras;
2. Tecniche asettiche per la protezione dell’operatore, delle colture cellulari e dell’ambiente, in particolare allo studente sarà spiegato l'uso di una cappa biologica sterile, l'utilizzo di materiale sterile e i comportamenti necessari per preservare tale sterilità;
3. Curve di crescita cellulare e tempo di raddoppiamento in vitro in particolare NIH3T3 immortalizzate e trasformate con l'oncogene K-Ras saranno analizzate in diverse condizioni di crescita;
4. Utilizzo di una tecnica che permette l’introduzione di acidi nucleici all’interno di cellule di mammifero, mediante una metodica chimica, in un processo definito "trasfezione”, in particolare sarà utilizzata la tecnica del Calcio-Fosfato;
5. Quantizzazione proteica mediante saggio spettrofotometrico, in particolare lo studente valuterà la concentrazione proteica di un estratto cellulare mediante metodo Bradford;
6. Analisi di attività enzimatica mediante saggio spettrofotometrico, in particolare lo studente analizzerà l'attivita enzimatica della proteina beta-galattosidasi;
7. Analisi di espressione proteica mediante microscopia a fluorescenza, in particolare lo studente analizzerà l'espressione della proteina Green Fluorescent Protein in seguito alla sua espressione mediante un plasmide in cellule di mammifero;
8. Analisi di espressione proteica mediante tecnica western blot, in particolare lo studente eseguirà la completa procedura utilizzata per analizzare l'espressione della proteina Green Fluorescent Protein in seguito alla sua espressione mediante un plasmide in cellule di mammifero;
9. Analisi critica dei risultati ottenuti mediante l'utilizzo delle sopraindicate tecniche.
Prerequisiti
Prerequisiti: Frequenza del corso di Biochimica.
Propedeuticità specifiche: nessuna
Propedeuticità generali: lo studente potrà sostenere l'esame solo previo superamento degli esami di Istituzioni di Biologia, Chimica generale ed inorganica e Matematica, Lingua Straniera.
Modalità didattica
Ciascun modulo didattico viene erogato a gruppi di 35-40 studenti, attraverso lezioni pratiche che si svolgono presso un laboratorio didattico. L’esecuzione di esperimenti è preceduta da brevi lezioni introduttive di ciascun argomento. La discussione dei risultati sperimentali, generalmente alla fine di ciascun modulo didattico, avrà luogo nello stesso laboratorio didattico. Per maggiori dettagli si rimanda al calendario delle lezioni di LTA (v. sito del CdL in Biotecnologie).
Materiale didattico
Il materiale didattico (dispense, slide, dati sperimentali) è disponibile sulla pagina e-learning dell'unità didattica di LTA-Biochimica.
Periodo di erogazione dell'insegnamento
Secondo semestre
Modalità di verifica del profitto e valutazione
Esame scritto di 2 h. La prova consiste di 6 domande a risposta multipla e 2 domande aperte che prevedono una risposta articolata e dettagliata.
Orario di ricevimento
Ricevimento: su appuntamento, previa richiesta per mail ai docenti.
Aims
The course aims to provide students with the theoretical and practical knowledge to manage basic experimental methodologies for biochemical analysis, through the execution of simple experiments of protein expression and analysis in mammalian cells and the discussion of results.
Knowledge and understanding. To consolidate and deepen basic knowledge of theoretical, technical and methodological issues already presented by the course of biochemistry.
Applying knowledge and understanding. To be able to correctly interpret the experimental protocols of biochemistry, recognize their salient aspects, collect and process experimental data.
Making judgments. To develop a critical vision of the experimental design and of the results achieved. To be able to recognize the context for appropriate application of the experimental procedures methods learned during the course.
Communication skills. To be able to elaborate experimental data and describe the results in an appropriate language and with the correct technical terms.
Learning skills. To be able to correctly interpret experimental protocols in contexts different from those used during the practical laboratory experience.
Contents
1. Manipulation and propagation of mammalian cells in vitro;
2. Aseptic techniques for the protection of the operator, the cell culture and the environment;
3. Cell growth curves and in vitro doubling time;
4. Use of a technique that allows the introduction of nucleic acids into mammalian cells, using a chemical method, in a process called "transfection";
5. Protein quantization by spectrophotometric assay;
6. Analysis of enzymatic activity by spectrophotometric assay;
7. Protein expression analysis by fluorescence microscopy;
8. Protein expression analysis by western blot;
9. Analysis and critical discussion of the results obtained from the use of the above techniques.
Detailed program
1. In vitro manipulation and propagation of mouse and human cells, in particular will be used NIH3T3 cells either immortalized or transformed with the K.Ras oncogene;
2. Aseptic techniques for the protection of the operator, the product (cells) and the environment, in particular the student will be introduced to the use of a sterile biological hood, the use of sterile material and the necessary behaviors to preserve such sterility;
3. Cell growth curves and in vitro doubling time, in particular will be used NIH3T3 cells either immortalized or transformed with the K.Ras oncogene grown in different growth conditions;
4. Use of a technique that allows the introduction of nucleic acids into mammalian cells, using a chemical method, in a process called "transfection", in particular the technique of Calcium-Phosphate will be used;
5. Protein quantization by spectrophotometric assay, in particular the student will evaluate the protein concentration of a cell extract using the Bradford method;
6. Enzymatic activity analysis using a spectrophotometric assay, in particular the student will analyze the enzymatic activity of the beta-galactosidase protein;
7. Analysis of protein expression by fluorescence microscopy, in particular the student will analyze the expression of the Green Fluorescent Protein following its expression by transfection in mammalian cells;
8. Protein expression analysis by western blot technique, in particular the student will perform the complete procedure used to analyze the expression of the Green Fluorescent Protein following its expression by transfection in mammalian cells;
9. Critical analysis of the results obtained through the use of the aforementioned techniques.
Prerequisites
Background: participation in the Biochemistry course.
Specific prerequisites: none
General prerequisites: Students can take the exams of the second year after passing the examinations of Introductory Biology, General and inorganic Chemistry, Mathematics, and Foreign Language.
Teaching form
Each learning unit is addressed to a group of 35-40 students, through practical lessons which are carried out in a teaching laboratory. At the beginning of each lesson, theory, aims and experimental design will be exposed. At the end of each module, an overall discussion of collected results will take place in the same laboratory. For further details, please, refer to lesson calendar on the website of Biotechnology course.
Teaching language: italian.
Textbook and teaching resource
Learning material (slides of introductory lessons, handout, experimental data) is available at the e-learning platform of LTA-Biochemistry module.
Semester
Second semester
Assessment method
Two-hour written examination, consisting of six multiple choise questions and two open questions that require comprehensive and detailed answers.
Office hours
Contact: on demand, upon request by mail to lecturers.